Differentiation of basic calcium phosphate and calcium pyrophosphate deposition in articular cartilage

Abstract

Osteoarthritis (OA) is a degenerative disease of the joint that is accompanied by structural, functional and metabolic changes in articular structures including cartilage, menisci, synovium, and bone. Calcification of articular cartilage is a common event in OA joints and involves the pathological deposition of calcium crystals in the extracellular matrix. Intra-articular calcium crystals can be divided into Basic calcium phosphate (BCP) and Calcium pyrophosphate (CPP) crystals. Individual BCP crystals are of submicroscopic size and their formation is associated with cartilage degradation, chondrocyte hypertrophy and OA progression. CPP crystals are of larger, needle-shaped morphology and have been linked to chondrocyte senescence. Calcified deposits can be detected with various methods including conventional radiography, microscopy and spectroscopy that come with several limitations. Thus, detection and differentiation of BCP and CPP crystals in calcified cartilage remains difficult, leading to conflicting data on prevalence and distribution. The formation of BCP and CPP is proposedly determined by extracellular levels of inorganic phosphate (Pi) and pyrophosphate (PPi). However, the formation process largely remains elusive. Therefore, this thesis aimed to differentiate BCP and CPP calcification in articular cartilage in regards to prevalence, distribution and formation. Calcification was detected using conventional radiography, and histological von Kossa staining. Crystals were identified using Raman spectroscopy. Radiological calcification was detected in 38% of patients. In contrast, histological cartilage calcification was found in 88% of patients, indicating the superior sensitivity of histological over radiological detection methods. Topologically, BCP was located on the cartilage surface and in the deep zone, while CPP deposition was limited to the superficial to intermediate cartilage. To elucidate the formation of BCP and CPP in cartilage, I analysed the expression of enzymes of the extracellular PPi metabolism using quantitative RT-PCR. Additionally, enzymatic activity, Pi and PPi levels were assessed using specific assays. Specifically BCP-calcified cartilage showed elevated expression and activity of tissue non-specific-alkaline phosphatase (TNAP). This was accompanied by increased Pi concentration and an elevated Pi/PPi ratio, suggesting that BCP deposition in cartilage is driven by an imbalance in the extracellular PPi metabolism in favour of Pi. Instead, CPP deposition could not be explained by a dysregulated PPi metabolism. To investigate the formation of CPP, I induced chondrocyte calcification in vitro. In response to ATP, chondrocytes from CPP-calcified cartilage produced CPP, while BCP-cartilage-derived chondrocytes were only able to produce BCP, suggesting an inherent, ATP-associated mechanism for CPP formation. In light of the recent association between CPP calcification and senescence, I measured senescence-associated cytokines and chemokines in synovial fluid of BCP versus CPP-calcified joints by multiplex assay. CPP-calcified joints showed upregulated senescence-associated cytokines and chemokines, hinting towards increased senescence. In line with these findings, chondrocytes from heavily calcified menisci contained dense cytosolic accumulations of CPP crystals. This was accompanied by elevated intracellular PPi concentrations and decreased Pi/PPi ratio, suggesting an intracellular pathway of CPP formation.

Osteoarthrose (OA) ist eine degenerative Gelenkserkrankung, die mit strukturellen, metabolischen und funktionellen Einschränkungen in allen Bestandteilen des Gelenks einhergeht. Kalzifikation im Knorpel stellt ein häufiges Phänomen dar und entsteht durch die pathologische Ablagerung von Calciumkristallen in der extrazellulären Matrix. Intra-artikuläre Kalziumkristalle können in Basische Calciumphosphat (BCP) und Calciumpyrophosphat (CPP) Kristalle unterteilt werden. BCP Kristalle haben eine submikroskopische Größe und ihre Bildung hängt eng mit Knorpeldegradierung, OA Fortschreitung und einer hypertrophen Differenzierung von Chondrozyten zusammen. CPP Kristalle weisen eine größere, nadelförmige Morphologie auf und wurden kürzlich mit Seneszenz von Chondrozyten in Verbindung gebracht. Kalzifikationen können mit verschiedenen Methoden detektiert werden, unter anderem konventioneller Radiographie, Mikroskopie und Spektroskopie. Jede dieser Methoden weist jedoch Schwächen auf, die die Detektion und Differenzierung von BCP- und CPP- Kristallen im Knorpel erschweren. Dies führt zu widersprüchlichen Daten über Prävalenz und Verteilung von BCP- und CPP-Ablagerungen. Die Kristallbildung hängt mit der Konzentration von Phosphat (Pi) und Pyrophosphat (PPi) zusammen. Die genauen Mechanismen, die zur Ablagerung von BCP- oder CPP-Kristallen führen, sind allerdings noch nicht bekannt. Das Ziel dieser Arbeit ist es daher, BCP- und CPP-Kalzifikationen im Knorpel mit verschiedenen Methoden zu detektieren und im Hinblick auf Detektion, Prävalenz und Bildung zu differenzieren. Kalzifikationen wurden radiologisch und histologisch detektiert. Die Art der Kristalle wurde mithilfe von Raman Spektroskopie identifiziert. In 38% der Patienten konnten radiologische Kalzifikationen des Kniegelenks festgestellt werden. Histologisch wurden dahingegen Kalzifikationen in 88% festgestellt. Während BCP-Ablagerungen auf der Knorpeloberfläche und in der tiefen Knorpelschicht zu finden waren, lagerten sich CPP-Kristalle ausschließlich in der mittleren Knorpelschicht ab. Um die Kristallbildung im Knorpel zu untersuchen, habe ich die Expression von Enzymen des extrazellulären PPi-Metabolismus mittels quantitativer RT-RCR untersucht. Enzymatische Aktivität, sowie die Konzentration von Pi und PPi wurden mithilfe von speziellen Assays gemessen. BCP- kalzifizierter Knorpel zeigte dabei eine erhöhte Expression und Aktivität von tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP), begleitet von einer gesteigerten Pi-Konzentration sowie Pi/PPi Ratio. Folglich scheint die Bildung von BCP-Kristallen durch eine Dysregulation des extrazellulären PPi-Metabolismus gesteuert zu sein, während dies jedoch nicht die Bildung von CPP-Kristallen erklären kann. Zur Untersuchung der Bildung von CPP-Kristallen habe ich Chondrozyten aus kalzifiziertem Knorpel isoliert und diese mittels ATP zur Kalzifikation stimuliert. Chondrozyten aus CPP-kalzifiziertem Knorpel waren in der Lage, CPP- und BCP-Kristalle zu bilden, während Chondrozyten aus BCP-kalzifiziertem Knorpel lediglich BCP-Kristalle produzierten. Diese Beobachtung deutet auf einen inhärenten, ATP-assoziierten Mechanismus zur Bildung von CPP-Kristallen hin. Im Hinblick auf den kürzlich gezeigten Zusammenhang zwischen CPP-Kalzifikation und zellulärer Seneszenz im Knorpel, habe ich daraufhin verschiedende Seneszenz-assoziierte Faktoren in der Synovialflüssigkeit aus BCP- und CPP- kalzifizierten Kniegelenken gemessen. CPP-Kalzifikation war mit einer erhöhten Konzentration einiger Seneszenz-assoziierter Zytokine und Chemokine verbunden, was auf eine erhöhte Seneszenz in diesen Gelenken hindeuten könnte. In vitro zeigten Chondrozyten aus stark kalzifizierten Menisken eine große Ansammlung von CPP-Kristallen im Zytoplasma. Diese war mit einer erhöhten intrazellulären PPi- Konzentration sowie einer verminderten Pi/PPi Ratio verbunden. Insgesamt deuten diese Ergebnisse auf einen intrazellulären Mechanismus zur Bildung von CPP-Kristallen hin, während BCP-Kristalle vermutlich extrazellulär entstehen.