Leishmania major drives host phagocyte death and cell -to-cell transfer depending on intracellular pathogen proliferation rate

Abstract

The virulence of intracellular pathogens relies largely on the ability to survive and replicate within phagocytes, but also on the release and transfer into new host cells. Such cell-to-cell transfer could represent a target for counteracting microbial pathogenesis. However, our un- derstanding of the underlying cellular and molecular processes remains woefully insufficient. Therefore, we studied Leishmania major ( L. major) cell-to-cell transfer among monocyte-de- rived cells and investigated the involvement of monocyte-derived host cell death and altered host cell metabolism in such transfer events. Using depletion of Leishmania-permissive CD11c-expressing monocyte-derived host cells in vivo, we were able to show that CD11c+ cells play a dual role in the ongoing infection, functioning both as host cells for L. major parasites and as inducers of iNOS, an important contributor in Leishmania clearance. In order to study L. major transfer among these monocyte-derived cells, we quantified L. major transfer and uptake of host cell material together with the parasite into adoptively transferred cells in vivo using intravital 2-photon microscopy analysis and flow cytometry analysis of CD11c-YFP reporter mice. Transfer of the parasite to new host cells occurred directly without a detectable extracellular state, and was associated with concomitant uptake of cellular material from the original host cell. By visualising cell death using live cell imaging, and using intravital 2-photon imaging of a Förster resonance energy transfer-based (FRET-based) cell-death-biosensor, we next studied whether apoptosis of the original host affects L. major transfer. Using intravital 2-photon microscopy of caspase-3 activation in the L. major-infected live skin and using a caspase-3 reporter assay in L. major-infected human monocyte-derived macrophages, we showed increased apoptosis in cells infected by the parasite. To see whether intracellular par- asite proliferation affects the fate of the infected host cell, we studied intracellular L. major proliferation in relation to cellular changes in murine intraperitoneal and bone marrow-derived macrophages using a photoconversion-based proliferation biosensor in vitro. In this regard, we observed a relation between high pathogen proliferation and cell death in infected cells, and long-term residency within an infected host cell was only possible for slowly proliferating parasites. Interestingly, using proliferation-modified parasites, we were able to show that L. major proliferation induced cell death of the infected host cell and that intracellular parasite proliferation rate modified host cell metabolic pathways. More specifically, intracellular para- site proliferation reduced glucose uptake and increased the expression of CD36, a glycopro- tein involved in high fatty acids uptake, in infected host macrophages. Regarding parasite proliferation and the microenvironment, we showed, using intravital imaging of the prolifera- tion biosensor-infected murine ear dermis, that high proliferating parasites were more often observed in close proximity to blood vessels as compared to low proliferating parasites. This might be due to reduced control by macrophages or by the increased likelihood of newly re- cruited monocyte-derived host cells present in this area. Lastly, we showed that IL-11 receptor signalling, which is suggested to play a role in phagocytosis, does not play a major role in recruitment and infection of monocytes during L. major infection in vivo. Taken together, our results suggest that L. major drives its own dissemination to new phagocytes by inducing host cell death in a proliferation-dependent manner. To our knowledge, we are the first to show evidence that L. major stimulates dissemination among phagocytes through parasite prolifer- ation-dependent cell death. This newly obtained knowledge can serve as a starting point for the creation of innovative treatments that can inhibit the establishment of intracellular path- ogens at their site of infection.

Die Virulenz intrazellulärer Krankheitserreger hängt weitgehend von ihrer Fähigkeit ab, in Pha- gozyten zu überleben und zu replizieren, aber auch von der Freisetzung aus solchen Pha- gozyten und dem Transfer in neue Wirtszellen. Dieser Zell-zu-Zell-Transfer könnte ein An- griffspunkt für die Bekämpfung der mikrobiellen Pathogenese sein, aber die zugrunde liegen- den zellulären und molekularen Prozesse sind nach wie vor wenig charakterisiert. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit der Zell-zu-Zell-Transfer des Parasiten Leishmania major ( L. major) zwischen monozytenabgeleiteten Wirtszellen und die Beteiligung des Zelltods und Verände- rungen im Stoffwechsel von infizierten Wirtszellen an diesen Prozessen untersucht. Mithilfe der Depletion von Leishmania-permissiven CD11c-exprimierenden monozytenabgeleiteten Wirtszellen in vivo konnten wir zeigen, dass CD11c+-Zellen eine doppelte Rolle bei der lau- fenden Infektion spielen und sowohl als Wirtszellen für L. major, als auch als Induktoren von iNOS, einem wichtiger Faktor bei der Beseitigung von Leishmanien, fungieren. Um den L. ma- jor-Transfer zwischen monozytenabgeleiteten Zellen zu untersuchen, quantifizierten wir den L. major-Transfer und die Aufnahme von Wirtszellmaterial zusammen mit dem Parasiten in adoptiv übertragene Zellen in vivo mithilfe der intravitalen 2-Photonen-Mikroskopie und einer Durchflusszytometrie von CD11c-YFP-Reportermäuse. Die Übertragung des Parasiten auf neue Wirtszellen erfolgte direkt ohne erkennbaren extrazellulären Zustand und war mit der gleichzeitigen Aufnahme von Zellmaterial aus der ursprünglichen Wirtszelle verbunden. Als nächstes untersuchten wir, ob die Apoptose der ursprünglichen Wirtszelle den L. major- Transfer beeinflusst, indem wir den Zelltod im lebenden Gewebe visualisierten, wofür wir einen auf Fluoreszenzresonanzenergietransfer basierenden (FRET-basierten) Apoptose-Biosensor für die intravitale 2-Photonen-Bildgebung verwendeten. Mit diesem experimentellen Tiermo- dell und unter Verwendung eines Caspase-3-Reporter-Assays in mit L. maior infizierten menschlichen monozytenabgeleiteten Makrophagen zeigten wir eine erhöhte Apoptose in mit dem Parasiten infizierten Zellen. Um herauszufinden, ob die intrazelluläre Parasitenprolifera- tion das Schicksal der infizierten Wirtszelle beeinflusst, untersuchten wir die intrazelluläre L. major-Proliferation in Bezug auf zelluläre Veränderungen in murinen intraperitonealen und aus dem Knochenmark differenzierten Makrophagen unter Verwendung eines auf Photokon- version basierenden Proliferationsbiosensors in vitro. In diesem Zusammenhang beobachteten wir einen Zusammenhang zwischen hoher Pathogenproliferation und Zelltod in infizierten Zel- len, und ein langfristiger Aufenthalt in einer infizierten Wirtszelle war nur für langsam prolife- rierende Parasiten möglich. Interessanterweise konnten wir mithilfe proliferationsmodifizierter Parasiten zeigen, dass die Proliferation von L. major den Zelltod der infizierten Wirtszelle in- duzierte und dass die intrazelluläre Parasitenproliferationsrate den Stoffwechsel der Wirtszelle veränderte. Genauer gesagt reduzierte die intrazelluläre Parasitenvermehrung die Glukose- aufnahme und erhöhte die Expression von CD36, einem Glykoprotein das an der Aufnahme hoher Fettsäuren beteiligt ist. In Bezug auf die Parasitenproliferation zeigten wir außerdem mithilfe intravitaler Mikroskopie, dass stark proliferierende Parasiten häufiger in unmittelbarer Nähe von Blutgefäßen beobachtet wurden als niedrig proliferierende Parasiten, was möglich- erweise darauf zurückzuführen ist, dass in diesem Bereich vermehrt neu rekrutierte aus mo- nozytenabgeleiteten Wirtszellen vorhanden sind, für die bekannt ist, dass sie eine hohe Pa- thogenproliferation begünstigen. Schließlich haben wir gezeigt, dass die Signalübertragung des IL-11-Rezeptors, von dem angenommen wird, dass er eine Rolle bei der Phagozytose spielt, bei der Rekrutierung und Infektion von Monozyten während einer L. major-Infektion in vivo keinen Einfluss hat. Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass L. major seine eigene Verbreitung in neue Phagozyten vorantreibt, indem der Parasit den Zelltod des Wirts in proliferationsabhängiger Weise induziert. Unseres Wissens nach sind wir die ersten, die Be- weise dafür vorlegen konnten, dass L. major die Ausbreitung zwischen Phagozyten durch den durch die Proliferation des Parasiten bedingten Zelltod stimuliert. Dies kann als Ausgangs- punkt für die Entwicklung innovativer Behandlungen dienen, die die Etablierung intrazellulärer Krankheitserreger an ihrem Standort hemmen können Ort der Infektion.