Design, Synthese und Charakterisierung von Inhibitoren für die Deubiquitinasen STAMBPL1 und USP48

Abstract

Ubiquitinierung ist eine häufig vorkommende posttranslationale Modifikation. Diese kann als Mono- oder Polyubiquitinierung vorliegen. Eine Ubiquitinierung kann eine Markierung von Proteinen für den Abbau durch das Proteasom bedeuten oder aber komplexere Vorgänge, wie bspw. Protein- Interaktionen, -Lokalisation oder enzymatische Aktivität regulieren. Durch Deubiquitinasen (DUBs) kann die Ubiquitinierung umgekehrt werden. Dabei sind DUBs an vielen wichtigen Signalpfaden beteiligt, weshalb sie ein interessantes Ziel für die Entwicklung niedermolekularer Inhibitoren sind. Aufgrund der stark konservierten aktiven Zentren innerhalb der einzelnen DUB-Klassen gilt es als schwierig, selektive DUB-Inhibitoren zu entwickeln. Aus diesem Grund sind bislang vergleichsweise wenige spezifische DUB-Inhibitoren beschrieben. Für die DUBs STAMBPL1 und USP48, konnte die Beteiligung an wichtigen Signalpfaden nachgewiesen werden, jedoch sind für beide bislang noch keine niedermolekularen Inhibitoren beschrieben. Ausgehend von Screenings kommerziell verfügbarer Substanzbibliotheken, die im Vorfeld zu dieser Arbeit am Institut für Experimentelle Innere Medizin (IEIM) der Otto-von-Guericke Universität unter Leitung von Prof. Dr. Michael Naumann durchgeführt wurden, wurde in dieser Arbeit versucht, Inhibitoren für die DUBs STAMBL1 und USP48 zu entwickeln. Für STAMBL1 wurden dabei fünf Grundstrukturen identifiziert, die hinsichtlich der Struktur- Wirkungsbeziehung (SAR) untersucht werden sollten. Zu allen fünf dieser scaffolds wurden retrosynthetische Untersuchungen angestellt, um mögliche Syntheserouten zu finden und die entsprechenden Synthesen zu etablieren. Es wurde jeweils eine kleine Reihe von Derivaten synthetisiert. Unter den synthetisierten Inhibitorkandidaten wies jedoch keiner eine nennenswerte inhibitorische Aktivität auf, sodass die Ergebnisse des Screenings nicht bestätigt werden konnten. Im Falle von USP48 konnte der Literaturbekannte USP2-Inhibitor ML-364 (ebenfalls am IEIM) als vielversprechender Ausgangspunkt für die Inhibitorentwicklung identifiziert werden. Die SAR des auf ML-364 basierenden Scaffolds wurde mittels eines ligandenbasierten Ansatzes untersucht. Zu diesem Zweck wurden mehrere Reihen von Analoga zu ML-364 synthetisiert und am IEIM auf ihre inhibitorische Aktivität hin untersucht. Einige dieser Analoga wiesen eine höhere inhibitorische Aktivität als ML-364 auf. Am IEIM wurde das aktivste der synthetisierten Derivate und ML-364 hinsichtlich der Selektivität gegenüber einer Reihe von anderen DUBs untersucht. Hierbei zeigte sich, dass beide keine Selektivität aufwiesen. Somit konnte die ursprünglich beschriebene Selektivität von ML-364 für USP2 bzw. USP8 nicht bestätigt werden. Mittels in silico Methoden konnte zudem gezeigt werden, dass ML-364 und die in dieser Arbeit synthetisierten Inhibitoren vermutlich an eine in USPs konservierte Bindetasche binden, wodurch sich die mangelnde Selektivität erklären ließe.

Ubiquitinylation is a common posttranslational modification, which can occur as mono- or polyubiquitinylation. It affects many cellular processes like degradation of proteins, protein- interactions and -localization or enzymatic activity. Deubiquitinylases (DUBs) are capable of reversing ubiquitinylation. DUBs are involved in many important signal-pathways, making them an interesting target for the development of small molecule inhibitors. Due to the highly conserved active sites within the individual DUB classes, it is considered difficult to develop selective DUB inhibitors. For this reason, comparatively few specific DUB inhibitors have been described so far. The involvement of the DUBs STAMBPL1 and USP48 in important signaling pathways has been demonstrated. However, no small molecule inhibitors have yet been described for either of them. Based on screenings of commercially available substance libraries that were carried out prior to this work at the Institute of Experimental Internal Medicine (IEIM) of the Otto-von-Guericke-University under the direction of Prof. Dr. Michael Naumann, this work attempted to develop inhibitors for the DUBs STAMBL1 and USP48. For STAMBL1, five scaffolds were identified that were investigated with regard to the structure-activity relationship (SAR). Retrosynthetic studies were carried out on all the five scaffolds to find possible synthesis routes, to establish the corresponding syntheses. A small series of derivatives were synthesized for each. However, none of the synthesized inhibitor candidates showed any significant inhibitory activity, so the results of the screening could not be confirmed. In the case of USP48, the literature-known USP2 inhibitor ML-364 was identified as a promising starting point for inhibitor development by the IEIM. The SAR of the ML-364-based scaffold was investigated using a ligand-based approach. For this purpose, several series of analogues to ML-364 were synthesized and tested for their inhibitory activity at the IEIM. Some of these analogues showed higher inhibitory activity than ML-364. At the IEIM, the most active of the synthesized derivatives and ML-364 were investigated for selectivity over a number of other DUBs. It was shown that both showed no selectivity. Thus, the originally described selectivity of ML-364 for USP2 and USP8 could not be confirmed. Using in silico methods, it was also shown that ML-364 and the inhibitors synthesized in this work most likely bind to a binding pocket conserved in USPs, which could explain the lack of selectivity.