Die Rolle der β1/β2-Integrin-Aktivierung in hämatopoetischen Zellen bei der Expression pro-inflammatorischer Zytokine in JAK2-V617F-positiven Myeloproliferativen Neoplasien

Abstract

Inflammatorische Zytokine spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese und der Progression von JAK2-V617F-mutierten Myeloproliferativen Neoplasien. Die genauen molekularen Mechanismen, die zu einer Hochregulation von inflammatorischen Zytokinen wie IL-1α, IL-1β, IL-6 und TNF-α im Serum von MPN-Patienten führen, sind bisher weitestgehend unklar. Frühere Untersuchungen unserer Forschungsgruppe zeigten, dass die JAK2-V617F-Mutation zu einer konstitutiv aktivierten β1/β2-Integrin-Konformation auf hämatopoetischen Zellen führt und damit zu einer verstärkten Bindung an die Adhäsionsmoleküle VCAM-1 und ICAM-1. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Hypothese untersucht, ob die aberrante Integrinaktivierung auf hämatopoetischen Zellen eine funktionelle Rolle in der Induktion von inflammatorischen Zytokinen bei MPN spielt. Zunächst wurden verschiedene hämatopoetische Zellpopulationen des Vav1-Cre x JAK2 MPN-Mausmodells bezüglich ihrer intrazellulären IL-1α und pro-IL-1β Konzentrationen, sowie ihrer Caspase-1 Aktivität untersucht. Dabei wurden Progenitorzellen, CD41+ (Megakaryozyten) und B-Zellen als wesentliche Quelle dieser Zytokine im JAK2- V617F-mutierten Mausmodell identifiziert. Erstmals wurde eine zelltyp-spezifische, durch Zelladhäsion an VCAM-1/ICAM-1-induzierte Caspase-1 Aktivierung gezeigt. Eine JAK2- V617F-spezifische Aktivierung nach Stimulation mit VCAM-1/ICAM-1 wurde dabei lediglich in CD41+ Zellen nachgewiesen und deutet dabei auf eine besondere Rolle der CD41+ Zellen in der MPN-Pathogenese hin. Interessanterweise induzierte die Adhäsion an mVCAM-1/mICAM- 1 die Hochregulation der Genexpression pro-inflammatorischer Zytokine wie Il1a, Il1b, Il6 und Tnf in verschiedenen hämatopoetischen Zellpopulationen des Vav1-Cre x JAK2 MPN- Mausmodells und in einem MPN-Zellkulturmodell (32D JAK2/EPOR Zellen). In 32D JAK2/EPOR-Zellen wurde dies durch die JAK2-V617F-Mutation verstärkt, während die Adhäsions-induzierte Hochregulation der mRNA-Expression in den primären Zellen überwiegend JAK2-V617F-unabhängig erfolgte. Wir konnten darstellen, dass dies auf eine Aktivierung des Integrin outside-in Signaling unter Beteiligung der Signalknoten FAK, Syk, NFκB und PI3K/AKT zurückzuführen ist. Dabei erfolgte die Adhäsions-induzierte mRNA- Expression hauptsächlich über die β1-Integrin-VCAM-1 Interaktion und wurde lediglich durch die β2-Integrin-ICAM-1-Interation verstärkt. Abweichende, jedoch nicht additiv wirkende, Signalwege wurden dabei beobachtet. Im Gegensatz zu den hämatopoetischen Zellen des Vav1-Cre x JAK2 Mausmodells konnte in den 32D JAK2/EPOR Zellen auch auf Proteinebene erhöhte inflammatorische Zytokinspiegel nach Stimulation mit immobilisiertem VCAM-1/ICAM- 1 nachgewiesen werden, die durch die JAK2-V617F-Mutation verstärkt wurden. Interessanter- weise konnten die signifikant erhöhten IL-1α Konzentrationen im Serum der Vav1-Cre x JAK2VF/+ durch eine anti-β1/β2-Integrin-Behandlung supprimiert werden. Zusammengefasst zeigen die hier vorgestellten Daten eine funktionelle Bedeutung der Zelladhäsion an VCAM- 1/ICAM-1 für die Induktion inflammatorischer Zytokine bei MPN.

Inflammatory cytokines play an essential role in the pathogenesis of JAK2-V617F mutated myeloproliferative neoplasm and in disease progression. The underlying molecular mechanisms of elevated pro-inflammatory cytokines as IL-1α, IL-1β, IL-6 and TNF-α in MPN- patient serum are currently unknown. Earlier observations of our group showed constitutively activated β1/β2-integrine conformation and increased ligand binding to VCAM-1 and ICAM-1 as a result of JAK2-V617F mutation in granulocytes. We hypothesized that aberrant integrin activation on hematopoietic cells may play a functional role in induction of pro-inflammatory cytokines in MPN. To evaluate this, various hematopoietic cell populations in the Vav1-Cre x JAK2-V617F MPN mouse model were analyzed according to intracellular IL-1α and pro-IL-1β content and caspase-1 activity. In addition to megakaryocytes and B-cells, progenitor cells were identified as an important source of inflammatory cytokines. Also for the first time, a celltyp-specific VCAM-1/ICAM-1-stimulation-induced mechanism of caspase-1 activation was shown. In CD41+ cells, this was specific for JAK2-V617F mutated cells suggesting an important role of CD41+ cells in pathogenesis of MPN. Interestingly, adhesion on immobilized mVCAM- 1/mICAM-1 induced gene expression pro-inflmmatory cytokines as Il1a, Il1b, Il6 and Tnf in different hematopoietic cell populations isolated from the Vav1-Cre x JAK2-V617F MPN mouse model and in the MPN cell culture model (32D JAK2/EPOR cells). In 32D JAK2/EPOR cells, expression was increased by the JAK2-V617F mutation, while the adhesion-induced mRNA expression was JAK2-V617F independent in the majority of cell populations. We successfully demonstrated the involvement of integrin outside-in signaling involving the signaling nodes FAK, Syk, NFκB and PI3K/AKT. mRNA expression of inflammatory cytokines was selectively induced by β1-integrin-VCAM-1 interaction and was further increased by β2-integrin-ICAM-1 interaction. Different signaling pathways involved were detected, but showed no additive effects. In 32D JAK2/EPOR cells, stimulation using immobilized mVCAM-1/mICAM-1 also led to an increase of pro-inflammatory cytokines on a protein level, which was further increased by the JAK2-V617F mutation. In contrast, in hematopoietic cells from the Vav1-Cre x JAK2 mouse model, no VCAM-1/ICAM-1 induced increase of pro-inflammatory cytokine levels was detectable. Nevertheless, interestingly, elevated IL-1α serum concentrations found in Vav1- Cre x JAK2VF/+ mice were inhibited by anti-α4β1/β2-integrin antibody treatment. In summary, the presented data show the functional relevance of cell adhesion on VCAM-1 and ICAM-1 in inflammatory cytokines in JAK2-V617F mutated cells.