Autophagy in motion: neuronal activity and behavior guide long-distance autophagic vesicle transport in Locus coeruleus axons projecting to the prefrontal cortex

Abstract

Autophagy is a complex intracellular process that enables cells to sequester damaged proteins, toxic metabolic byproducts, and other cellular components for subsequent degradation or recycling. Its efficiency is particularly crucial for neurons, which are required to function throughout the entire lifespan of an organism. In fact, insufficient autophagy is frequently associated with neurodegeneration in context of both disease and aging. Noradrenergic neurons of the locus coeruleus (LC-NE) are exceptionally vulnerable to degeneration, and both the endo-lysosomal system and autophagy pathways play a role in eliminating polymerized catecholamine derivatives. Moreover, the LC-NE is among the first brain regions affected by the accumulation of beta-amyloid deposits, resulting in Alzheimer`s disease. LC-NE neurons extend long, extensively branched axons throughout the brain, and their reliance on volume transmission suggests that presynaptic regulatory mechanisms, particularly those involving adrenergic G-protein-coupled receptors, govern autophagic vesicle (AV) trafficking in LC-NE axons to ensure timely cargo degradation. Interestingly, a tightly regulated exchange of membranous compartments between adjacent neuronal populations, specifically the LC-NE and the (Me5) neurons, has been suggested preventing LC-NE neurodegeneration. My thesis explores network-related cellular mechanisms regulating neuronal proteostasis in the locus coeruleus via autophagy. Using state-of-the-art technologies like in vivo imaging and in vivo fiber-mediated photoconversion I investigated two key aspects of autophagy regulation in noradrenergic axons: (1) how neuronal activity, behavior, and norepinephrine release influence the trafficking pattern and velocity of autophagic vesicles in distal axons; (2) the role of the endo-lysosomal system and autophagy in cargo disposal within the somatodendritic region of the LC-NE . I found that during their navigation through the distal LC axons projecting to the PFC, AVs exhibit distinct trafficking velocities and directions in vivo under conditions of spontaneous LC-NE activity. These AVs can be categorized into three distinct populations: (i) slow bidirectional, (ii) fast bidirectional, and (iii) slow unidirectional. Next, I found that the chemogenetic inhibition of LC-NE activity unifies the trafficking directionality of LC3B-positive vesicles, promoting a shift from bidirectional to unidirectional motility within LC-NE axons projecting to the PFC in vivo. Inhibition changes the representation of distinct populations of autophagic vesicles classified as (i) slow unidirectional, (ii) fast unidirectional, and (iii) extra fast unidirectional. Using optical fiber-mediated photoconversion of mEos4-LC3B at the distal axons targeting the PFC, I observed photoconverted “red” LC3B-positive puncta in the somata of LC-NE neurons. This suggests that the shift in directionality from anterograde to retrograde is associated with the delivery of autophagic vesicles to the cell soma of LC-NE neurons. Additionally, mEos4-LC3B vesicles were SIPA1L2-positive, suggesting that LC3B+ vesicles are amphisomes - hybrid organelles on the autophagy pathway. Conversely, stimulation of LC-NE activity through stress-induced behavior, mimicked by exposure to a novel environment, altered AV trafficking by reducing the number of AVs reaching the cell soma from distal axons projecting to the PFC. By employing LC-NE-specific labeling, I found that β2ARs are presynaptically expressed at distal LC axons projecting to the PFC. To elucidate whether AV trafficking is regulated by an autocrine mechanism and to identify the temporal correlations between AV trafficking patterns, such as stopovers and mobilizations, and NE release, an innovative NE sensor (GRABNE2h) was employed alongside a fluorescent AV marker (mRuby3-LC3). The findings revealed that AV trafficking initiation follows a significant reduction in NE release, whereas mobile AVs tend to pause when NE levels increase at the imaged distal axon. The investigation into molecular mechanisms of AV motility regulation reveals that Spinophilin, a regulatory subunit of PP1, associates with both, SIPA1L2 and dynein adaptor Snapin, and might provide local regulation for Snapin dephosphorylation, facilitating its reassociation with motor complex and subsequent vesicle mobilization. I identified previously overlooked, significant differences in lysosomal machinery between tyrosine hydroxylase-positive neurons of the LC-NE and neighboring mesencephalic trigeminal neurons (Me5). The levels for the autophagy receptor p62 are also differentially regulated across these neuronal nuclei. LC-NE-specific viral transduction with the mRuby3-LC3B autophagy marker revealed the presence of mRuby3-LC3B puncta within the adjacent Me5 somata. My findings suggest a functional interplay between these neuronal populations, indicating that LC-NE neurons may utilize secretory autophagy as an alternative pathway for cargo disposal when their intrinsic degradative capacity is compromized. Finally, I found that under LC-NE inactivation, Sec22b puncta, a marker for secretory autophagy, were scarcely detectable. These findings support the notion that the activity state of LC-NE neurons may regulate secretory autophagy and membrane exchange between LC-NE and Me5 neurons. Thus, Me5 neurons may facilitate the clearance of damaged proteins and metabolites from LC-NE neurons, highlighting a potential cooperative mechanism in maintaining neuronal proteostasis. Overall, my results indicate the LC-NE employ a different logistics for the trafficking of autophagic vesicles for somatic delivery at diverse activity states, regulated by the autocrine mechanism. Retrograde transport and AV velocities appeared to be enhanced during LC-NE inactivation, potentially reflecting REM sleep conditions, during which AVs exhibit increased velocity in reaching the somata. The suggested molecular mechanism for mobilization might involve Spinophilin and PP1-mediated effect of Snapin dephosphorylation, requiring reassociation with the dynein motor. A cell-to-cell communication between LC-NE and Me5 might serve as a compensatory system providing digestive assistance for highly demanding neurons such as LC-NE.

Autophagie ist ein komplexer intrazellulärer Prozess, der es Zellen ermöglicht, beschädigte Proteine, toxische Stoffwechselnebenprodukte und andere zelluläre Bestandteile zu isolieren, um sie anschließend abzubauen oder zu recyceln. Seine Effizienz ist besonders entscheidend für Neuronen, die während der gesamten Lebensdauer eines Organismus funktionsfähig bleiben müssen. Tatsächlich wird eine unzureichende Autophagie häufig mit Neurodegeneration im Zusammenhang mit Krankheiten als auch mit dem Alterungsprozess in Verbindung gebracht. Noradrenerge Neuronen des Locus coeruleus (LC-NE) sind außergewöhnlich anfällig für Degeneration, wobei sowohl das endo-lysosomale System als auch Autophagie-Wege eine Rolle beim Abbau polymerisierter Katecholamin-Derivate spielen. Darüber hinaus gehört der LC zu den ersten Hirnregionen, die von der Akkumulation von Beta-Amyloid Ablagerungen betroffen sind, was zur Alzheimer-Krankheit führt. LC-NE-Neuronen projizieren lange, stark verzweigte Axone in das gesamte Gehirn, und ihre Wirkung über Volumenübertragung legt nahe, dass präsynaptische Regulationsmechanismen – insbesondere jene, die adrenerge G-Protein- gekoppelte Rezeptoren einbeziehen – den Transport autophagischer Vesikel (AV) in LC-NE-Axonen steuern, um einen zeitgerechten Cargo-Abbau sicherzustellen. Interessanterweise wurde ein streng regulierter Austausch membranöser Kompartimente zwischen benachbarten Neuronenpopulationen, speziell zwischen dem LC-NE und dem mesenzephalen Trigeminuskern (Me5), als Mechanismus vorgeschlagen, der einer LC-NE-Neurodegeneration vorbeugen könnte. Meine Dissertation untersucht netzwerkbezogene zelluläre Mechanismen, die die neuronale Proteostase im Locus coeruleus über Autophagie regulieren. Mithilfe modernster Technologien wie In-vivo-Bildgebung und in-vivo faservermittelter Photokonversion habe ich zwei zentrale Aspekte der Autophagieregulation in noradrenergen Axonen untersucht: Wie neuronale Aktivität, Verhalten und Noradrenalinfreisetzung das Transportmuster und die Geschwindigkeit autophagischer Vesikel in distalen Axonen beeinflussen, und die Rolle des endo-lysosomalen Systems und der Autophagie beim Cargo-Abbau im somato-dendritischen Bereich des LC-NE. Ich stellte fest, dass AVs während ihrer Navigation durch die distalen LC-Axonen, die zum präfrontalen Kortex (PFC) projizieren, in vivo unter Bedingungen spontaner LC-NE-Aktivität unterschiedliche Transportgeschwindigkeiten und -richtungen aufweisen. Diese AVs können in drei unterschiedliche Populationen eingeteilt werden: (i) langsam bidirektional, (ii) schnell bidirektional und (iii) langsam unidirektional. Weiterhin ergab sich, dass die chemogenetische Hemmung der LC-NE-Aktivität die Transportrichtungsbestimmung der LC3B-positiven Vesikel vereinheitlicht, indem sie einen Wechsel von bidirektionaler zu unidirektionaler Motilität innerhalb der LC-NE-Axonen, die zum PFC projizieren, in vivo fördert. Unter der Hemmung verhalten sich die Populationen autophagischer Vesikel als (i) langsam unidirektional, (ii) schnell unidirektional und (iii) extra schnell unidirektional. Mithilfe der optischen faservermittelten Photokonversion von mEos4-LC3B in den distalen Axonen, die den PFC erreichen, beobachtete ich photokonvertierte „rote“ LC3B⁺ Punkta in den Zellkörpern der LC-NE-Neuronen. Dies legt nahe, dass der Richtungswechsel von anterograd zu retrograd mit dem Transport autophagischer Vesikel in den Zellkörper der LC-NE-Neuronen verbunden ist. Zusätzlich waren mEos4-LC3B-Vesikel SIPA1L2-positiv, was darauf hindeutet, dass sie Amphisomen - hybride Organellen des Autophagiewegs - darstellen. Im Gegensatz dazu führte die Stimulation der LC-NE-Aktivität durch stressinduziertes Verhalten, simuliert durch die Exposition in einer neuartigen Umgebung, zu einer veränderten AVTrafficking- Dynamik, indem die Anzahl der AVs, die von distalen Axonen zum PFC den Zellkörper erreichen, reduziert wurde. Durch LC-NE-spezifische Markierung stellte ich fest, dass β2ARs präsynaptisch in den distalen LC-Axonen, die zum PFC projizieren, exprimiert werden. Um zu klären, ob das AV-Trafficking durch einen autokrinen Mechanismus reguliert wird und um die zeitlichen Zusammenhänge zwischen AV-Trafficking-Mustern - wie Zwischenstopps und Mobilisierungen - und der Noradrenalinfreisetzung zu identifizieren, setzte ich einen innovativen Noradrenalin-Sensor (GRABNE2h) zusammen mit einem fluoreszierenden AV-Marker (mRuby3-LC3) ein. Die Ergebnisse zeigten, dass die Initiierung des AV-Traffickings einer signifikanten Reduktion der Noradrenalinfreisetzung folgt, während mobile AVs dazu neigen, anzuhalten, wenn die Noradrenalinspiegel im distalen Axon ansteigen. Die Untersuchung der molekularen Mechanismen der Regulation der AV-Motilität ergab, dass Spinophilin, eine regulatorische Untereinheit von PP1, sowohl mit SIPA1L2 als auch mit dem Dynein-Adaptor Snapin assoziiert und möglicherweise eine lokale Regulation der Snapin-Dephosphorylierung ermöglicht, wodurch dessen erneute Assoziation mit dem Motorkomplex und die anschließende Vesikelmobilisierung erleichtert wird. Ich identifizierte bislang übersehene, signifikante Unterschiede in der lysosomalen Maschinerie zwischen Tyrosinhydroxylase-positiven Neuronen des LC-NE und benachbarten Me5 Neuronen. Auch die Spiegel des Autophagie-Rezeptors p62 sind in diesen neuronalen Kernen unterschiedlich reguliert. Durch LC-NE-spezifische virale Transduktion mit dem mRuby3-LC3B-Autophagie-Marker zeigte ich mRuby3-LC3B-Punkta in den benachbarten Me5-Zellkörpern. Meine Ergebnisse deuten auf ein funktionelles Zusammenspiel zwischen diesen Neuronenpopulationen hin, d.h. dass LC-NE-Neuronen sekretorische Autophagie als alternativen Weg zur Frachtentsorgung nutzen könnten, wenn ihre intrinsische Abbaukapazität beeinträchtigt ist. Schließlich fand ich, dass unter LC-NE-Inaktivierung Sec22b-Punkta, ein Marker für sekretorische Autophagie, kaum nachweisbar waren. Diese Befunde stützen die Annahme, dass der Aktivitätszustand der LC-NE-Neuronen die sekretorische Autophagie und den Membranaustausch zwischen LC-NE- und Me5-Neuronen regulieren könnte. Daher könnten Me5-Neuronen den Abbau beschädigter Proteine und Metaboliten aus LC-NE-Neuronen erleichtern und damit einen potenziellen kooperativen Mechanismus zur Aufrechterhaltung der neuronalen Proteostase darstellen. Insgesamt deuten meine Ergebnisse darauf hin, dass LC-NE-Neuronen unterschiedliche Logistikstrategien für den Transport autophagischer Vesikel zur somatischen Cargo-Entsorgung bei unterschiedlichen Aktivitätszuständen anwenden, die durch einen autokrinen Mechanismus reguliert werden. Der retrograde Transport und die Geschwindigkeiten der AVs scheinen unter LC-NE-Inaktivierung erhöht zu sein, was möglicherweise REM-Schlafbedingungen widerspiegelt, während derer AVs mit erhöhter Geschwindigkeit die Zellkörper erreichen. Der molekulare Mechanismus für die Mobilisierung könnte den Spinophilin- und PP1-vermittelten Effekt der Snapin-Dephosphorylierung beinhalten, der für die erneute Assoziation mit dem Dynein-Motor erforderlich ist. Die Zell-Zell-Kommunikation zwischen LC-NE und Me5 könnte als kompensatorisches System dienen, um stark beanspruchte Neuronen wie LC-NE zu unterstützen.