Investigations of the role of the Guanine nucleotide exchange factor ‚alpha-Pix’ in the development of Marginal Zone B cells and their homeostasis within the Marginal Zone

Abstract

Cellular motility is regulated by the spatiotemporal coordination of the Rho GTPases Cdc42 and Rac1, which act on PAK. αPix is a GEF for Rac1 and Cdc42 and is expressed almost exclusively by hematopoietic cells. The absence of αPix expression in mice results in an increased population of marginal zone B cells (MZB) in the spleen and an increased motility of lymphocytes was reported. Therefore, the first part of the present study investigated the role of αPix in the development and the second part in the motility of MZB. In this study, it could be shown that the absence of αPix leads to a dislocation of MZB from the marginal zone to the red pulp. However, the data from this study suggest that this mis-localization from the marginal zone to the red pulp is not the cause of the increased MZB population in αPix-deficient mice. However, a slight shift of precursor populations within the MZB from T1 to T2 could be measured. The shift of MZB progenitor cells from the T1 to the T2 population is an indication that αPix may be involved in the Cdc-42-regulated differentiation processes of MZB. Although this was a small shift, long-term effects of αPix deficiency could lead to an increased MZB population. MZB population development and homeostasis are regulated by complex mechanisms involving a variety of different factors. Further research is needed to fully understand MZB development and homeostasis. In the past, increased motility has been reported in αPix-deficient lymphocytes. In the course of this work, it was shown that the absence of αPix expression also leads to increased motility in MZB. αPix-deficient MZB show increased βPix expression to compensate for the loss of αPix. We speculate that increased βPix expression may in turn lead to increased Rac1 activity, which could be the cause of the increased motility. Increased expression of chemokine receptors on the surface of MZB could be excluded. As described above, the examination of αPix ko MZB with conventional experimental setups showed clear effects of αPix deficiency on MZB, but further detailed analysis of αPix ko MZB was unfortunately not readily available. One reason for this was, for example, a difficult cell sorting procedure with the eventual availability of only low cell numbers of MZB for in vitro analyses. Furthermore, conventional adhesion assays, both static and flow-through, showed insufficient resolution or sensitivity. Due to these limitations of conventional experimental setups, an innovative setup was developed to investigate the increased motility of αPix ko MZB in more detail. For this purpose, a constant flow chamber system was combined with a live cell imaging system with time-lapse capability. This system was used for the first time to investigate the migration behaviour of MZB under laminar flow. The functionality of this system was demonstrated and proven by showing that MZB migrate upward on ICAM-1 under flow and tend to stick to VCAM-1 and have a tendency to migrate with the flow. This behaviour differed from the adhesion behaviour of follicular B cells and thus previously described observations could be reproduced. Furthermore, the present work demonstrated that αPix is involved in the regulation of shear force- and S1P-induced migration responses of MZB, probably through the regulation of integrin complexes. The absence of αPix leads to flushing or mis-localization of MZB from the MZ toward the red pulp, and this drift is triggered by blood flow. Finally, the present study identified and described other factors that regulate MZB migration under blood flow: Shear Force, S1P, ICAM-1, and VCAM-1. These were used to propose a model for MZB cell positioning. The opposing forces of ICAM-1 and flow on the one hand, and VCAM-1 and S1P signalling through S1PR3 on the other, determine whether an MZB cell remains in the marginal zone, migrates toward the follicle, or is washed out into the red pulp. These data were published in Nature Communications. The experimental setup of the flow system developed in this study provides a new and wide range of possibilities to study the adhesive and migratory behaviour of immune cells. The design and handling of this innovative system was published in "Journal of Visualized Experiments".

Die zelluläre Motilität wird durch die räumlich-zeitliche Koordination der Rho-GTPasen Cdc42 und Rac1 reguliert, die auf PAK wirken. αPix ist ein GEF für Rac1 und Cdc42 und wird fast ausschließlich von hämatopoetischen Zellen exprimiert. Das Fehlen der αPix Expression in Mäusen führt zu einer vergrößerten Population von Marginalzonen B Zellen (MZB) in der Milz und es wurde eine erhöhte Motilität von Lymphozyten berichtet. Daher wurde im ersten Teil der vorliegenden Studie die Rolle von αPix bei der Entwicklung und im zweiten Teil bei der Motilität von MZB untersucht. Im Rahmen dieser Forschungsarbeit konnte gezeigt werden, dass die Abwesenheit von αPix zu einer Dislokation der MZB aus der Marginalzone in die Rote Pulpa führt. Die Daten dieser Studie deuten jedoch darauf hin, dass diese Dislokalisierung aus der Marginalzone in die Rote Pulpa nicht die Ursache für die vergrößerte MZB-Population in αPix-defizienten Mäusen ist. Es konnte aber eine leichte Verschiebung der Vorläuferpopulationen innerhalb der MZB von T1 zu T2 gemessen werden. Die Verschiebung von MZB-Vorläuferzellen von der T1- zur T2-Population ist ein Hinweis, dass αPix an der Cdc-42 regulierten Differenzierungsprozessen von MZB beteiligt sein könnte. Obwohl es sich nur um eine kleine Verschiebung handelte, könnten langfristige Effekte einer αPix-Defizienz zu einer vergrößerten MZB-Population führen. Die Entwicklung und Homöostase der MZB-Population wird durch komplexe Mechanismen unter Einbindung einer Vielzahl verschiedener Faktoren reguliert. Um die Entwicklung und Homöostase der MZB vollständig zu verstehen, sind weitere Forschungen erforderlich. In der Vergangenheit wurde bei αPix-defizienten Lymphozyten eine erhöhte Motilität berichtet. Im Zuge dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Fehlen der αPix Expression auch bei MZB zu einer erhöhten Motilität führt. αPix-defiziente MZB zeigen eine erhöhte βPix-Expression, um den Verlust von αPix zu kompensieren. Wir vermuten, dass die erhöhte βPix-Expression wiederum zu einer erhöhten Rac1-Aktivität führen könnte, was die Ursache für die erhöhte Motilität sein könnte. Eine erhöhte Expression von Chemokin-Rezeptoren auf der Oberfläche von MZB konnte ausgeschlossen werden. Wie oben beschrieben, zeigte die Untersuchung von αPix ko MZB mit konventionellen Versuchsanordnungen deutliche Effekte einer αPix-Defizienz auf MZB, aber eine weitere detaillierte Analyse von αPix ko MZB war ohne Weiteres leider nicht möglich. Ein Grund dafür war z. B. ein schwieriges Zellsortierverfahren mit der letztendlichen Verfügbarkeit von nur geringen Zellzahlen von MZB für in-vitro-Analysen. Weiterhin zeigten herkömmliche Adhäsionsassays, sowohl statisch als auch im Durchfluss nur unzureichende Auflösung bzw. Empfindlichkeit. Aufgrund dieser Einschränkungen herkömmlicher Versuchsaufbauten wurde ein innovativer Aufbau entwickelt, um die erhöhte Motilität von αPix ko MZB genauer untersuchen zu können. Dazu wurde ein Durchflusskammersystem mit konstantem Fluss mit einem Live-Zell-Imaging-System mit Zeitrafferfunktion kombiniert. Mit diesem System wurde erstmals das Migrationsverhalten von MZB unter laminarer Strömung untersucht. Die Funktionalität dieses Systems konnte dadurch gezeigt und nachgewiesen werden, dass MZB unter Strömung an ICAM-1 aufwärts wandern und an VCAM-1 eher haften bleiben und eine Tendenz zur Wanderung mit dem Strom haben. Dieses Verhalten unterschied sich vom Adhäsionsverhalten der follikulären B-Zellen und somit konnten bereits beschriebene Beobachtungen reproduziert werden. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass αPix an der Regulierung der Scherkraft- und S1P-induzierten Migrationsreaktionen von MZB beteiligt ist, wahrscheinlich durch die Regulierung von Integrinkomplexen. Das Fehlen von αPix führt zu einem Ausspülen bzw. Dislokalisierung von MZB aus der MZ in Richtung der Roten Pulpa und dieser Drift wird durch den Blutfluss ausgelöst. Schließlich konnten in der vorliegenden Studie weitere Faktoren identifiziert und beschrieben werden, die die MZB-Migration im Blutfluss regulieren: Scherkraft, S1P, ICAM-1 und VCAM-1. Diese wurden verwendet, um ein erweitertes Modell für die Positionierung von MZB-Zellen in der Marginalzone vorzuschlagen. Die gegensätzlichen Kräfte von ICAM-1 und Strömung auf der einen Seite und VCAM-1 und S1P-Signalisierung durch S1PR3 auf der anderen Seite bestimmen, ob eine MZB-Zelle in der Marginalzone verbleibt, dem Follikel entgegen wandert oder in die Rote Pulpa ausgewaschen wird. Diese Daten wurden in Nature Communications veröffentlicht. Der experimentelle Aufbau des im Rahmen dieser Studie entwickelten Durchflusssystems bietet ein neues und weites Spektrum von Möglichkeiten zur Untersuchung des adhäsiven und migratorischen Verhaltens von Immunzellen. Der Aufbau und die Handhabung dieses innovativen Systems wurde in "Journal of Visualized Experiments" veröffentlicht.