BONCAT- and click chemistry-based enrichment of phages and newly synthesized proteins from anaerobic digesters

Abstract

Die Anaerobic Digestion (AD, anaerobe Vergärung) beschreibt den mikrobiellen Abbau organischer Substanzen unter Ausschluss von Sauerstoff, wobei Methan (CH₄) und Kohlendioxid (CO₂) entstehen. Anaerobic Digesters (AD-P, anaerobe Vergärungsanlagen) nutzen die AD durch mikrobielle Gemeinschaften zur Erzeugung erneuerbarer Energie in Form von Biogas. Das Verständnis dieser mikrobiellen Gemeinschaften in AD-Ps ist entscheidend für einen optimalen Anlagenbetrieb, insbesondere im Hinblick auf Prozessdesign, Substratzusammensetzung und Betriebsparameter. Prokaryotische Viren (sogenannte Phagen) werden in AD-Ps häufig übersehen, obwohl sie Mikroorganismen infizieren, verändern und lysieren können. Der Nachweis von Phagen in AD-Ps wirft Fragen zu ihrer Funktion in großtechnischen Anlagen auf: Sie könnten entweder Prozessstörungen verursachen, wenn essentielle funktionelle Mikroben verloren gehen, oder das Wachstum auxotropher Bakterien durch Nährstoffkreisläufe unterstützen. Um Phagen und ihren potenziellen Einfluss auf AD-Ps zu untersuchen, wurden die Dynamiken einer mikrobiellen Gemeinschaft und ihrer Phagen über den Zeitraum eines Jahres in einer zweistufigen AD-P mittels metagenomzentrierte Metaproteomik analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl Prozessdesign als auch Substratzufuhr die mikrobielle Zusammensetzung und die Phagenreplikation beeinflussten. Einige der identifizierten Phagen korrelierten mit der Häufigkeit ihrer Wirte, was auf mögliche Phagen-Wirt-Interaktionen hinweist. Der Nachweis eines Antibiotikaresistenzgens in einem Phagen verdeutlicht zudem die Rolle des horizontalen Gentransfers im AD-Prozess. Einzelne Arten dominierten häufig den Abbau bestimmter Substrate. Theoretisch lysieren Phagen dominante Arten und regulieren so die Biodiversität („killing the winner“). Dieser Effekt konnte im untersuchten Zeitraum jedoch nicht beobachtet werden. Der Nachweis von CRISPR-Cas-Proteinen weist auf eine mikrobielle Abwehr gegen Phagen hin, dennoch konnten keine eindeutigen Phagen-Wirt-Beziehungen identifizert werden. Trotz des Einsatzes fortgeschrittener metagenomischer und metaproteomischer Methoden blieben die meisten Phagenproteine nahe der Nachweisgrenze, und nur 17 von 137 identifizierten Phagenproteinen konnten einem metagenome-assembled genome (MAG, metagenomisch zusammengesetztes Genom) zugeordnet werden. Diese Ergebnisse lieferten erste Einblicke in Phagen-Wirt-Dynamiken, zeigten jedoch auch, dass aktuelle Omics-Methoden nicht ausreichen, um die funktionale Bedeutung von Phagen in AD-Ps vollständig zu klären. Daher wurden neue Methoden entwickelt, um zukünftige Untersuchungen von Phagen in AD-Ps zu ermöglichen. Ziel war die spezifische Isolierung von Phagen zusammen mit ihren Wirtsorganismen aus komplexen mikrobiellen Gemeinschaften, die Anreicherung von Phagen für Sequenzierung und Massenspektrometrie (zur Erhöhung des Signals) sowie die Identifizierung neu synthetisierter Proteine (newly synthesized proteins, nPs), die Rückschlüsse auf die Aktivität von Wirt und Phage erlauben. Zu diesem Zweck wurden Arbeitsabläufe entwickelt, die Bioorthogonal Non-Canonical Amino Acid Tagging (BONCAT) und click chemistry (Click-Chemie) kombinieren. BONCAT markiert nPs, während Click-Chemie deren selektive Modifikation und Anreicherung ohne Beeinträchtigung der Proteinstruktur ermöglicht. Der erste Workflow zielte darauf ab, aktive Phagen zusammen mit ihren Wirtszellen zu detektieren und zu isolieren. Anhand eines Escherichia coli- und Phage λ-Modells wurde gezeigt, dass BONCAT markierte Phagen erfolgreich mit Fluoreszenzfarbstoffen oder Biotin markiert werden können, ohne ihre Infektiosität zu beeinträchtigen. Dieser Workflow ermöglichte die Bindung fluoreszenzmarkierter Phagen an ihre Wirtszellen und den Nachweis von Phagen-Wirt-Komplexen durch Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie. Darüber hinaus konnten biotinylierte Phagen mithilfe monomerer Avidin-Beads gereinigt werden, was ein gezieltes Wirts-Screening ermöglicht. Proben aus AD-Ps sind hochkomplex und enthalten zahlreiche Verunreinigungen. Dies erschwert die Phagendetektion erheblich und behindert die Implementierung von BONCAT- und Click-Chemie basierten Phagen-Workflows. Ein neu entwickelter Phagen-Anreicherungsworkflow, der Ultrazentrifugation und Filtration kombiniert, verbesserte die Trennung von Zellen und Phagen sowie die Phagenkonzentration. Dadurch stieg die Anzahl detektierter Phagenproteine in der Phagenfraktion einer landwirtschaftlichen AD-P-Probe um das Sechsfache. Diese Ergebnisse belegen die Effektivität des Anreicherungsworkflows und bilden die technische Grundlage für die Anwendung von BONCAT- und Click-Chemie-basierten Phagen-Workflows in AD-Ps. Der zweite Workflow, ebenfalls BONCAT- und Click-Chemie-basiert, zielte auf die Anreicherung von nPs in komplexen mikrobiellen Gemeinschaften aus AD-Ps, um die Proteinsynthese mittels Massenspektrometrie nachzuweisen. In einem Modellsystem aus BONCAT-markierten E. coli und unmarkierter Hefe wurde eine selektive Anreicherung -spezifischer Proteine erreicht, wobei unspezifische Hefehintergründe um mehr als 96 % reduziert wurden. Der Workflow wurde erfolgreich auf eine anaerobe mikrobielle Gemeinschaft aus einem Labor-Biogasanlagenreaktor übertragen. Nach Umstellung des Substrats auf Ethanol konnten ethanolabbauende syntrophe Mikroorganismen anhand ihrer nPs identifiziert werden. Dieser Workflow eröffnete damit die Möglichkeit, Mikroorganismen anhand ihrer nPs während Phageninfektionen oder anderer Umweltstressfaktoren zu untersuchen. Die neu entwickelten Workflows wurden in Batchkulturen getestet, die aus einem anaeroben Laborbiogasreaktor inokuliert und zur Induktion von Phagen Umweltstress ausgesetzt wurden. Der Großteil der mittels metagenomzentrierter Metaproteomik identifizierten Phagengenome und -proteine konnte ausschließlich über den entwickelten Phagen-Anreicherungsworkflow nachgewiesen werden. Ergänzende Elektronenmikroskopie der angereicherten Phagenfraktion bestätigte eine hohe Phagenvielfalt. Die Annotation der identifizierten Proteine als Phagenproteine hing stark von der jeweils verwendeten Phagen-Annotationspipeline ab. Es lässt sich demnach ableiten, dass die Kombination verschiedener Phagen-Annotationswerkzeuge für Phagenstudien von essenzieller Bedeutung ist. Der proteomische Nachweis der vorhergesagten Phagenproteine in der angereicherten Phagenfraktion bestätigte die Wirksamkeit des entwickelten Workflows. Interessanterweise wurden Phagengenome meist entweder in der Zell- oder in der Phagenfraktion detektiert, während Phagenproteine in beiden Fraktionen auftraten. Trotz geringer BONCAT-Markierung der nPs gelang eine Anreicherung in beiden Fraktionen, was erste Einblicke in mikrobielle Anpassungsstrategien und Phagen-Wirt-Interaktionen ermöglichte. So konnten beispielsweise Interaktionen zwischen Pseudomonas aeruginosa und einem virulenten Phagen sowie zwischen Bacillus und einem temperenten Phagen anhand ihrer nPs analysiert werden. In dieser Arbeit wurden flexibel nutzbare, BONCAT- und Click-Chemie-basierte Workflows entwickelt, um die Proteinsynthese mikrobieller Gemeinschaften zu analysieren und mikrobielle sowie Phagen-Wirt-Interaktionen in AD-Ps zu erforschen.

Anaerobic digestion (AD) involves microbial communities decomposing organic matter without oxygen, producing methane (CH₄) and carbon dioxide (CO₂). Anaerobic digesters (AD-Ps) use AD from microbial communities to generate renewable energy in the form of biogas. Understanding these microbial communities of AD-Ps is crucial for optimal process operation, especially regarding process design, feedstock, and operational parameters. Prokaryotic viruses such as phages are often overlooked in AD-Ps, yet they can infect, modify, and lyse microorganisms. The identification of phages in AD-Ps raised questions about their function in full-scale AD-Ps, either causing process disturbances due to loss of essential functional microbes or supporting the growth of auxotrophic bacteria by nutrient cycling. To investigate phage and their potential influence on AD-Ps, the dynamics of a microbial community and its phages were investigated over a year in a two-step AD-P using metagenome-centric metaproteomics. The findings indicated that process design and feeding impacted microbial community composition and phage replication. Some of the identified phages correlated with host abundance, indicating potential phage-host interactions. The detection of an antibiotic resistance gene in a phage shows the role of horizontal gene transfer within the AD process. Individual species often dominated the degradation of specific substrates. Theoretically, phages lyse dominant species to regulate biodiversity (“killing the winner”). However, this effect could not be observed over the analyzed year. CRISPR-Cas proteins were identified, indicating microbial defense against phages, yet no clear phage-host interactions could be resolved. Despite the use of advanced metagenomic and metaproteomic techniques, most phage proteins remained near the detection limit, and only 17 of 137 of the identified phage proteins could be linked to a metagenome-assembled genome. These findings provided first insights into phage-host dynamics but also revealed that current omics approaches are insufficient to clarify the functional impact of phages on AD-Ps. Therefore, new methods were established to enable future investigations of phages in AD-Ps. The goal was to specifically isolate phages together with their hosts from complex microbial communities, enrich phages for high signal sequencing and mass spectrometry, and identify newly synthesized proteins (nPs) that reflect host and phage activity. To achieve this, workflows combining Bioorthogonal Non-Canonical Amino Acid Tagging (BONCAT) and click chemistry were developed. BONCAT labels nPs, while click chemistry allows their selective modification and enrichment without altering protein function. The first workflow aimed to detect and isolate active phages along with their host cells. Using an E. coli and phage λ model system, it was demonstrated that BONCAT-labeled phages could be successfully tagged with fluorescent dyes or biotin without losing their infectivity. This workflow enabled the binding of fluorescent phages to their host and the detection of phage-host complexes through fluorescence microscopy and flow cytometry. Additionally, biotinylated phages could be purified using monomeric avidin beads, allowing for potential host screening. Samples of AD-Ps are highly complex and contain many impurities. This presents a significant challenge for the detection of phages and hinders the implementation of BONCAT- and click chemistry-based phage workflows. A novel phage enrichment workflow integrating ultracentrifugation and filtration has been developed to improve cell and phage separation and phage concentration. The phage enrichment workflow led to a sixfold increase in detected phage proteins within the phage fraction of an agricultural AD-P sample, demonstrating its effectiveness and establishing the technical basis for BONCAT- and click chemistry-based phage workflows in AD-Ps. The second BONCAT- and click chemistry-based workflow targeted the enrichment of nPs in complex microbial communities of AD-Ps to detect protein synthesis via mass spectrometry. In a model system with BONCAT-labeled E. coli and unlabeled yeast, selective enrichment of -specific proteins was achieved with a reduction of non-specific yeast protein background by more than 96%. The workflow was successfully transferred to an anaerobic microbial community from a laboratory biogas reactor. After switching the substrate to ethanol, ethanol-degrading syntrophic microorganisms could be detected based on their nPs. This workflow also opened up the possibility of analyzing microorganisms based on their nPs during phage infection or other environmental stresses. The newly developed workflows were tested in batch cultures inoculated from an anaerobic laboratory biogas reactor and exposed to environmental stress to promote phage induction. The majority of identified phage genomes and proteins using metagenome-centric metaproteomics could only be detected through the developed phage enrichment workflow. Complementary electron microscopy of the enriched phage fraction confirmed a high diversity of phages. Annotation of identified proteins as phage proteins was highly dependent on the used phage annotation pipeline, indicating that combining various phage annotation tools is essential in phage studies. Proteomic detection of the predicted phage proteins in the enriched phage fraction provided essential confirmation. Interestingly, phage genomes were typically detected in either the cell or the phage fraction, whereas phage proteins were found in both fractions. Moreover, despite weak BONCAT labeling of nPs, enrichment was achieved for the cell fraction and the phage fraction, providing initial insights into microbial adaptation and phage-host interactions. For example, the phage-host interaction between Pseudomonas aeruginosa and a virulent phage, as well as between Bacillus and a temperate phage, could be analyzed based on their nPs. In this thesis, adaptable BONCAT- and click chemistry-based workflows were established for analyzing protein synthesis of microbial communities and elucidating microbial and phage-host interactions in AD-Ps.